【项目文献速递】水稻ChIP-Seq揭示转录因子ZFP36直接作用于OsAPX1基因以抑制种子萌发
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研究背景
种子萌发在植物生长发育过程中至关重要，需要严格控制以防在不利条件下萌发。ABA作为调节种子萌发的重要激素，可以通过抑制活性氧（ROS）生成、抗坏血酸（ASC）积累及赤霉素（GA）生物合成来抑制种子萌发，但ABA具体是如何在种子萌发过程中减少ROS的机制还未可知，而ZFP36（一种C2H2型锌指蛋白）是在非种子组织中调节水稻细胞ROS稳态的关键因素，如在水稻叶片中，ZFP36调控OsAPX1的表达，在ABA诱导增强APX表达和活性中起重要作用，但其是否参与ABA调节种子萌发尚未可知。
南京农业大学蒋明义教授课题组，以水稻种子为研究对象，通过ChIP-Seq、酵母双杂交实验、双分子荧光互补实验、GUS瞬时表达实验等研究了ABA如何通过ZFP36调节种子的萌发。
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材料与方法
材料：水稻（Oryza sativa L. sub.japonica cv. Nipponbare）的野生型（WT）种子、ZFP36过表达的ZFP36 OE种子和OsLEA5沉默的OsLEA5 RNAi种子。
方法：
1）蛋白互作实验：酵母双杂交实验（Yeast two-hybrid assay）、双分子荧光互补实验(BiFC )、免疫共沉淀实验（Co-IP）、GST pull-down实验。
2）ChIP-Seq：测序平台为北京百迈客生物科技有限公司Illumina HiSeq，PE125。
3）本氏烟草GUS瞬时表达实验。
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研究结果
1）ZFP36互作蛋白的发现
利用酵母双杂交实验，以ZFP36全长为诱饵对水稻cDNA文库进行筛选，发现了ZFP36的互作蛋白-- OsLEA5（图1A）。然后，通过将ZFP36和OsLEA5编码区分别克隆到pSPYCE和pSPYNE，在洋葱表皮细胞中进行双分子荧光互补实验(BiFC)，证明了ZFP36与OsLEA5在细胞核中相互作用（图1B）。最后，通过免疫共沉淀实验（Co-IP）、GST pull-down实验，分别证实了ZFP36与OsLEA5在体内和体外的直接互作关系（图1C、D）。
图1 ZFP36与OsLEA5在体内外的互作
2）ZFP36参与种子萌发的作用方式
为了研究ZFP36作为转录因子参与种子萌发的作用机制，通过ChIP在基因组范围内获得了与ZFP36结合的DNA片段，并对这些DNA片段进行测序。结果表明ZFP36与OsAPX1启动子结合，OsAPX1的起始密码子上游-1027 bp到-990 bp是ZFP36结合的富集位点，命名为BS37A（图2）。
图2 ZFP36与OsAPX1启动子结合位点示意图
在确定了ZFP36作为转录因子的靶向基因为OsAPX1之后，需要确定ZFP36对该基因的转录是起激活作用还是阻遏作用，因此本研究中利用GUS瞬时表达实验，构建了OsAPX1启动子与GUS 报告基因的融合基因，转入烟草叶片。结果表明，ZFP36可以增强OsAPX1启动子活性，OsLEA5可以进一步促进这个增强作用（图3）。此外， ZFP36 OE种子和OsLEA5 RNAi种子中，OsAPX1表达量和APX酶活性测定实验结果表明，ZFP36控制水稻种子中OsAPX1表达，OsLEA5参与了水稻种子中ABA对OsAPX1表达的调控（图3）。
图3 ZFP36增强OsAPX1启动子活性和APX酶活，OsLEA5是ZFP36的协同促进蛋白
3）OsLEA5和ZFP36互作在ABA抑制种子萌发中的作用
为了研究OsLEA5和ZFP36互作在ABA抑制种子萌发中的作用，用不同浓度的ABA对ZFP36 OE和OsLEA5 RNAi种子进行了处理。ZFP36 OE种子在外源ABA处理下表现出种子萌发和幼苗生长的延迟，OsLEA5 RNAi种子在外源ABA处理下表现出加速种子萌发和幼苗生长（图4），这表明ZFP36和OsLEA5参与调控水稻种子萌发中的ABA应答。
由于ZFP36和OsLEA5参与调控水稻种子萌发的ABA应答是通过作用于OsAPX1来实现的，而ASC是APX的底物，且可以直接与ROS作用清除ROS，因此ASC在这一调控过程中起重要作用。本研究中为了进一步研究ASC在调节ABA诱导的种子萌发抑制中的作用，对不同浓度的ABA处理后的水稻种子加以ASC处理。结果表明，ASC在一定程度上可以解除ABA对种子萌发的抑制作用（图4）。ASC在调节GA的积累过程中起着关键作用，而GA是种子萌发的激活剂，因此ABA抑制种子萌发部分是由ASC介导的。
图4 ZFP36和OsLEA5参与调控水稻种子萌发的ABA应答,且ASC参与ABA对种子萌发的抑制
【小结】ABA抑制水稻种子萌发的机制
ABA可以通过减少ROS的产生来抑制种子萌发，而APX是一种高效的活性氧清除剂。ROS和ASC在GA生物合成中起重要作用，而GA可以促进种子萌发，之前有研究表明APXs通过减少ROS和ASC，以控制GA生物合成来抑制种子萌发。本研究揭示了水稻种子ABA信号通路中，ZFP36作为转录因子作用于OsAPX1启动子，促进OsAPX1表达、增强APX酶活性，从而可以减少ROS和ASC以抑制种子萌发，且OsLEA5可与ZFP36结合促进这种抑制作用。
创新点
本研究从ABA信号通路中起重要作用的转录因子ZFP36入手，通过ChIP-Seq准确定位ZFP36的靶向基因OsAPX1及结合位点，并结合酵母双杂交等实验，揭示了ABA信号通路中，ZFP36及其互作蛋白OsLEA5通过直接靶向作用于OsAPX1，促进OsAPX1表达和增强APX酶活性以抑制种子萌发的机制。
参考文献
Huang L, Jia J, Zhao X, et al. The ascorbate peroxidase APX1 is a direct target of a zinc finger transcription factor ZFP36 and a late embryogenesis abundant protein OsLEA5 interacts with ZFP36 to co-regulate OsAPX1 in seed germination in rice.[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2018,495:339-345.
转录调控 杨 静丨文案
吴戈宇 | 审核
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